HLA新等位基因的发现、鉴定方法及申报流程HLA新等位基因 的觉察、审定办法及申报流程 课前导读 ? 人类白细胞抗原(Human Leukocyte Antigen, HLA)是位于人类第6号染色体短臂上一组慎密连锁 的基因群,是目昔人体中最具有众态性的遗传体系, 由三类基因构成,即Ⅰ类基因、Ⅱ类基因和Ⅲ类基因, 可能行为一个遗传单元或单倍型(haplotype)而遗 传给下一代,属共显性等位基因 ? 本课将核心先容HLA新等位基因的检测办法,审定 办法以及HLA新等位基因的数据申报流程 HLA新等位基因的觉察、审定办法及申报流程 HLA新等位基因的觉察 HLA新等位基因的审定办法 NCBI数据上传的使用 IMGT数据上传的使用 HLA新等位基因觉察的意思 HLA新等位基因的觉察、审定办法及申报流程 HLA新等位基因的觉察 HLA新等位基因的审定办法 NCBI数据上传的使用 IMGT数据上传的使用 HLA新等位基因觉察的意思 HLA新等位基因的觉察 ? SSP检测办法 SSP检测办法的实习道理 SSP检测经过中HLA新基因的识别 ? RSSO检测办法 RSSO检测办法的实习道理 RSSO检测经过中HLA新基因的识别 ? SBT检测办法 SBT检测办法的实习道理 SBT检测经过中HLA新基因的识别 RSSO检测办法的实习道理 ? 采用流式反向SSO手艺,道理是PCR基因片断扩增后使用 序列特异性寡核苷酸探针,通过杂交的办法举行扩增片断 的理会审定。探针与PCR产品正在肯定条款下杂交具有高度 的特异性,苛苛按照碱基互补的规则。探针用生物素非放 射性标帜举行相应的标帜物检测。流式细胞仪的激光束垂 直照耀正在样品流上,分别颜色的磁珠正在光束的照耀下,产 生散射光和胀励荧光,依据这两种信号的领受理会判决结 果 RSSO检测经过中HLA新基因的识别 Luminex SSOP 式样图 34号探针反响图 66号探针反响图 SSP检测办法的实习道理 ? HLA-基因位于第6对染色体短臂远端的一个窄小区域内,由一 群慎密连锁的基因构成,是人体内最为纷乱的遗传众态性系 统。PCR-SSP HLA基因分型的基础道理是依据HLA-I、II类基 因核苷酸的碱基序列,安排出一系列递次特异性引物,该引 物既针对型特异性又针对等位基因特异性,采用高特异耐热 DNA群集酶,通过PCR扩增各等位基因的型别特异性DNA片 段,扩增产品通过琼脂糖凝胶电泳,依据其特异性电泳区带 所正在的地位,即可确切指定一个等位基因,判决HLA型别 SSP检测经过中HLA新基因的识别 ? 进一步用PCR-SSP基因分型手艺举行理会,也显示无法 注明的反响式样 。 PCR-SSP电泳图 结果—PCR-SSP SBT检测办法的实习道理 ? 目标基因正在含有热启动DNA群集酶AmpliTaq Gold? 的 PCR混杂物中举行扩增。扩增产品进程ExoSAP-IT? (核酸 外切酶和小虾碱性磷酸酶的混杂物)措置,可去除未连接 的PCR引物和底物dNTPs。将措置后的扩增产品行为DNA 序列模板,介入含有测序引物以及BigDye? Terminators 行为终止剂的双脱氧链终止法测序反响。HARPs用于处分 优柔寡断的结果。全体的DNA序列通过DNA自愿序列分 析仪举行测定,Assign软件体系理会并指定等位基因 SBT检测经过中HLA新基因的识别 Atria试剂测得的序列电泳图 HLA新等位基因的觉察、审定办法及申报流程 HLA新等位基因的觉察 HLA新等位基因的审定办法 NCBI数据上传的使用 IMGT数据上传的使用 HLA新等位基因觉察的意思 HLA新等位基因的审定办法 HLA新等位基因的审定 分两举措举行 要是是通过SBT 觉察新基因,使 第 用另一种SBT检 一 测办法确定。 步 要是通过SSP、 RSSO觉察新基 因,拣选一种 SBT检测办法进 行序列确认。 第 二 步 利用分子克隆 手艺对新等位 基因举行最终 确认。 分子克隆手艺的界说 ? 依据WHO定名委员会的请求,呈递的新基因序列务必是 一条独立的基因序列,因为PCR产品直接测序取得的结果 为来自父母两条染色体等位基因的混杂序列结果,因此无 法取得孤独新基因的序列。古代办法常利用DNA克隆手艺 将两个等位基因隔离 ? 正在分子秤谌,克隆日常指DNA克隆(也叫分子克隆)。寄义 是将某一特定DNA片断通过重组DNA手艺插入到一个载 体(如质粒和病毒等)中,然后正在宿主细胞中举行自我复制 所取得的大批十足好像的该DNA片断的“群体” 分子克隆手艺的实习流程 ①载体的拣选和目标基因的取得 ②载体和目标基因的加工 ③载体和目标基因的连绵 ④重组DNA的转化和扩增 ⑤重组DNA的筛选和审定 分子克隆流程示贪图 基因组DNA PCR扩增 终局措置i 重组 转化 载体 剪切 分子克隆流程示贪图 B4801与4816序列电泳比对图 exon2 170 180 190 200 B*480101 GGAGGGGCCG GAGTATTGGG ACCGGGAGAC ACAGATCTCC B*4816 ---------- ---------- ------T--- ---------- exon2 210 220 230 240 B*480101 AAGACCAACA CACAGACTTA CCGAGAGAGC CTGCGGAACC B*4816 ---------- ---------- ---------- ---------- 新等位基因B*4816与等位基因 B*4801第2外显子序列比力 HLA新等位基因的觉察、审定办法及申报流程 HLA新等位基因的觉察 HLA新等位基因的审定办法 NCBI数据上传的使用 IMGT数据上传的使用 HLA新等位基因觉察的意思 考虑 HLA新基因申报数据的请求是什么? HLA新基因申报数据的流程是奈何